• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1986004353A1
    申请号:PCT/EP1986/000024
    申请日:1986-01-22
    公开日:1986-07-31
    发明作者:Klaus D. Kulbe；Gisela Knopki
    申请人:Fraunhofer-Gesellschaft Zur Förderung Der Angewand；
    IPC主号:C12P17-00
    专利说明:
    [0001] Verfahren zur intrasequentiellen Cof'aktor-Regeneration b enzymatischen Synthesen, insbesondere bei der Herstellun von Vitamin C
    [0002] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur intrasequen- . tiellen Cofaktor-Regeneration bei zwei- oder mehr¬ stufigen enzymatischen Synthesen. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung von Vitamin C oder L-Ascorbinsäure und zur Herstellung von Zwischen¬ produkten, die für die Herstellung von Vitamin C ver¬ wendet werden können.
    [0003] Chemische Reaktionen, die unter der Einwirkung von Enzymen als Katalysatoren ablaufen, besitzen unter anderem den großen Vorteil, daß die Reaktionen bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden, meist stereospezifisch verlaufen und der Bedarf an Hilfs¬ chemikalien minimal gehalten werden kann. Die Verwendung von Enzymen bei technischen oder halbtechnischen Syn¬ thesen hat jedoch, abgesehen "von Hydrolysereaktionen, bis jetzt nur beschränkte Anwendung 'gefunden. Dafür gibt es eine Anzahl von Gründen. Einer der Gründe ist, daß zahlreiche Enzyme nur in Gegenwart eines Cofaktors oder Coenzyms wirksam sind. Dies gilt z.B. für die Gruppe der Dehydrogenasen. Die Regeneration der Cofaktoren, insbesondere der Coenzyme, wie beispielsweise NAD oder FAD ist vor allem bei einer technischen Durchführung mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden. Es besteht daher Bedarf an enzymkatalysierten Verfahren, die auch halbtechnisch oder technisch durchgeführt werden können und bei denen Cofaktoren benötigt werden.
    [0004] Je umgesetztes Mol Substrat wird normalerweise auch 1 Mol des Cofaktors benötigt, welcher oftmals wesent¬ lich teurer ist als das zu gewinnende Produkt. Diese theoretisch unüberwindliche ökonomische Barriere kann nur dadurch genommen werden, indem man analog zu den in der lebenden Zelle ablaufenden Prozessen versucht - wie bei Enzymen üblich -/auch beim Cofaktor mit kata- lytischen Mengen auszukommen. Dazu benötigt man Cofaktor- Regenerationssysteme, deren Entwicklung in den letzten Jahren intensiv betrieben worden ist. Die Ergebnisse sind bisher jedoch noch bei weitem nicht optimal._ Die besten Resultate wurden bei enzymatischer Coenzym- Regeneration erhalten. Das einzige kurz vor einer größeren industriellen Anwendung stehende Verfahren be¬ trifft die Herstellung von L-Aminosäuren aus ent¬ sprechenden Ketosäuren durch reduktive enzymatische Transaminierung (M. . Kula, C.Wandrey Bioengineering 23_, S. 1341
    [0005] (1981)). Für die Eegeneration des im übrigen an ein lösliches Polymere gebundenen Coenzyms wird dort ein zweites Enzym verwendet, welches während seiner Reaktion aus Ameisensäure ledig¬ lich nicht störendes CO- produziert, ein jedoch letzt- lieh nicht nutzbares Produkt.
    [0006] In der DE-OS 33 26 546.1-42 (1983) wird dem¬ gegenüber erstmals ein technisch interessantes Ver¬ fahren beschrieben, bei welchem aus Gemischen von Glucose und Fructose, wie sie auch bei enzymtechnischer Hydrolyse aus Saccharose großtechnisch hergestellt werden, gleichzeitig zwei ökonomisch interessante Produkte erhalten werden. Während dabei Glucose durch Glucose-Dehydrogenase zu Gluconsäure oxidiert wird, ent- steht aus der Fructose in einer von Sorbitol- oder
    [0007] Mannitol-Dehydrogenase katalysierten Reduktionsreaktion D-Sorbitol bzw. D-Mannitol. Das in der Oxidations- reaktion reduzierte Coenzym (NAD ^ NADH _-__,.) wird parallel mit der Fructose-Reduktion reoxidiert (NADH- <_-_• NAD ) , so daß es für einen weiteren Cyclus zur Verfügung steht und dieser Prozeß kontinuierlich _r.**_iProdukte bei Gegenwart nur katalytischer Mengen von Enzym und Coenzym liefern kann: D-Gluconsäure
    [0008] D-Fructose
    [0009] D-Sorbitol
    D-Fructose
    [0010] In der Literaturstelle "Vitamin C" von U. Wintermeyer et al, Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart 1981, werden verschiedene Synthesen von Vitamin C beschrieben. Es finden sich jedoch keine Hinweise zur großtechnischen Herstellung von Vitamin C unter Verwendung von Enzymen als Katalysatoren.
    [0011] L-Ascorbinsäure (Vitamin C) wird großtechnisch nach wie vor nach dem von T. Reichstein und A. Grüssner (Helv. Chi . Acta V7, 311 (1934)) entwickelten chemischen Syntheseverfahren, ausgehend von D-Glucose, hergestellt.
    [0012] In dem folgenden Reaktionsschema sind die Einzelschritte der von Reichstein und Mitarbeitern entwickelten industriellen Synthese von L-Ascorbinsäure aus D- Glucose dargestellt.
    [0013]
    [0014]
    [0015] 1 _) Dabei werden folgende Stufen durchlaufen: D-Sorbit, L-Sorbose, 2-Keto-L-gulonsäure, L-Ascorbinsäure. Nicht berücksichtigt wurden hierbei zwei Zwischenstufen, welche die Einführung von zwei Isopropyliden-Schutz- gruppen in L-Sorbose und ihre Abspaltung aus dem Oxi¬
    [0016] 2 Ü dationsprodukt dieses Derivates betreffen. Auch die chemische Umwandlung von 2-Keto-L-gulonsäure in L-Ascorbinsäure erfordert diese Derivatisierung.
    [0017] Jeder dieser Schritte ist mit erheblichen Ausbeutever-
    [0018] ..5 lusten infolge der Bildung von Nebenprodukten verbunden. Insbesondere wird ein kontinuierlicher Verfahrensablauf durch die bis heute aus stereochemischen Gründen er¬ forderliche mikrobiologische Oxidation von D-Sorbit zu L-≤orbose unterbrochen. Auch nach nunmehr jahrzehnte¬
    [0019] 3 U langer Produktionserfahrung mit der entsprechenden Fermentation durch z.B. Gluconobacter suboxydans oder Acetobacter xylinus treten bis heute erhebliche Schwierig¬ keiten bei der Durchführung dieses Schrittes auf (vgl. K. Dannhäuser, Chem. Rdsch. 27, 40 (1974)). Rein ^ chemische Reaktionsschritte führen jedoch bei weitem nicht zu vergl ichbaren Ergebnissen in Bezug auf die Stereospezifität dieser Oxidation und somit auf die Reinheit des Produkts. Die Gesamtausbeute bezogen auf eingesetzte Glucose beträgt ca. 60%.
    [0020] In verschiedenen Laboratorien wurde in den letzten Jahren versucht, eine kontinuierliche Produktion von L-Sorbose mit Hilfe immobilisierter Mikroorganismen zu erreichen. Bisher ist jedoch kein hinreichend be¬ friedigendes Ergebnis erzielt worden. Außerdem muß auch hier mit ausbeutevermindernden Nebenprodukten und den daraus resultierenden Aufarbeitungsproblemen ge¬ rechnet werden.
    [0021] Es ist eine Reihe rein chemischer Synthesen von L-Ascor- binsäuren entwickelt worden, die aber aus wirtschaft- liehen Gründen ebenfalls keine Anwendung gefunden haben (T.C. Crawford, S.A. Crawford, Adv. Carbohydrate Chem. Biochem. 21_, 79 (1980)).
    [0022] Rein enzymatische Syntheseverfahren für Vitamin C sind bisher nicht beschrieben worden. J.P. Danehy (US-Patent 4,259,443, 1981) verwendet einen Extrakt aus keimenden Erbsensamen zur Umwandlung von Galactono-y-lacton in L-Ascorbinsäure. Dieser Schritt würde aber stöchio- metrische Mengen an Coenzym erfordern, was für ein Produktionsverfahren wirtschaftlich völlig untragbar wäre. Ganz davon abgesehen könnte dieser Prozeß in keinem Falle kontinuierlich geführt werden. Das bei der Verwen¬ dung einer Oxidase entstehende Nebenprodukt H-O-, würde zudem das Enzym sehr rasch inaktivieren.
    [0023] In der US-PS 2,681,858 wird die enzymatische Spaltung der Lactose durch 3-Galactosidase in D-Galactose und D-Glucose beschrieben. Die Überführung der Glucose und Galactose in die entsprechenden Uronsäure bzw. Uron- säurederivate unter Verwendung von Schutzgruppen ist ebenfalls bekannt: (US-Patent 4,259,443 1981; C.L. Mehltretter et al J. Amer. Chem. Soc. 73_, 2424 (1951)) . Jedoch sind bei diesem bekannten Verfahren die erziel¬ ten Ausbeuten an Uronsäuren zu gering für eine ökonomische In der US-PS 4,259,443 wird ein Verfahren zur Herstel¬ lung von L-Ascorbinsäure aus Lactose
    [0024] 1) durch Hydrolyse der Lactose in D-Galactose und 5 D-Glucose;
    [0025] 2) Oxidation der D-Galactose und D-Glucose zu D-Galactu- ronsäure und D-Glucuronsäure;
    [0026] 3) Reduktion der D-Galacturonsäure und D-Glucuronsäure zu der L-Galactonsäure und L-Gulonsäure; 0 4) Überführung der letztgenannten Säuren in die ent¬ sprechenden y-Lactone und 5) enzymatische Oxidation der y-Lac one zu L-Ascorbinsäure beschrieben. Dieses bekannte Verfahren besitzt den Nachteil, daß es nicht kontinuierlich durchgeführt werden •- kann und daß die Ausbeuten sehr -niedrig sind.
    [0027] Die Welt ahresproduktion an Vitamin C betrug im .Jahre 1981 ca. 35.000 Tonnen.- Davon wurde ein Großteil in er' Bundesrepublik Deutschland hergestellt. ü bύ bis 70% der Weltproüuktion an L-Ascorbinsäure gehen in die Lebensmittelindustrie. Es besteht daher ein steigender Bedarf an Vitamin C.
    [0028] 5 fjer vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Ver- fanren zur Herstellung von Vitamin C zur Verfügung zu stellen, das in cecni≤cneii. und lalbtechnischem Maßstab durchgeführt werden kann, bei αer Enzyme als Katalysatoren eingesetzt weruen unu welches die Regeneration der erforderlichen *-*1 cofaktoren ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren, b i dem Enzyme verwendet werden, soll auf wirtschaftliche Weise durchgeführt werden können, ohne daß untragbare Ver¬ luste entstehen. Es soll das gewünschte Produkt in hohen Ausbeuten ergeben. b
    [0029] Insbesondere soll erfindungsgemäß ein einfaches Verfahren zur Hersteϊlunc von Vitamin C oder seinen Vorstufen bzw. Zwischenprodukten zur Verfügung gestellt werden, gemäß dem Vitamin C bzw. seine Vorstufen oder Zwischenprodukte auf einfachere Weise und mit höheren Ausbeuten oder kosten¬ günstiger als bei den bekannten Verfahren hergestellt werden können. 5
    [0030] Insbesondere soll ein rein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure aus D-Galacturonsäure oder D-Glucuronsäure bzw. Gemischen von D-Glucuronsäure und D-Galacturonsäure zur Verfügung gestellt werden. Es 10 soll ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, gemäß dem durch enzymatische/chemische Verfahren diese Uron- säuren aus Lactose oder anderen leicht zugänglichen Ausgangsmaterialien, ie z.B. Glucose, Pectin, Alginsäure oder Gluconsäure, wirtschaftlich gewonnen werden können.
    [0031] 15
    [0032] Das erfindungsgemäße Verfahren, insbesondere das Ver¬ fahren zur Herstellung von Vitamin C oder seinen Vor¬ stufen oder Zwischenprodukten, soll, sich durch folgende Vorteile auszeichnen:
    [0033] 20
    [0034] 1. Verwendung von preiswerten Substraten, beispielsweise für die Vitamin-C-Herstellung Lactose, Glucose;
    [0035] 2. vollständige Verwertung der Substrate, beispielsweise der-Lactose;
    [0036] 25 - 3. keine Nebenprodukte bei den enzymatischen Schritten;
    [0037] 4. hoher Reinheitsgrad des gewünschten Endprodukts;
    [0038] 5. geringere Umwel belastung als bei chemischer Synthese;
    [0039] 6. das Verfahren soll kontinuierlich durchgeführt werden können;
    [0040] 30 7. es sollen kleinere Anlagen als bei einem chemischen Syntheseverfahren erforderlich sein und damit o. σeπn ere Investitionskosten benötigt werden.
    [0041] _.3 Während gemäß DS-OS 33 26 546.1-42 (1983) eine - wenn auch produktive - Hilfsreaktion zur Cofaktor-Regeneration benutzt wurde, wird nun erfindungsgemäß ein Verfahren zur intrasequentiellen Cofaktor-Regeneration insbesondere am Beispiel der Synthese von L-Ascorbinsäure beschrieben. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere für mehr¬ stufige enzymatische Synthesen, welche Oxidations- und Reduktionsschritte innerhalb der gleichen Synthese¬ kette enthalten.
    [0042] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur intrasequen¬ tiellen Cofaktor-Regeneration bei enzymatischen Synthesen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man im gleichen Reaktor oder in getrennten Stufen (D ein Substrat enzymatisch reduziert und das erhaltene Reduktionsprodukt enzymatisch in ein Oxidations¬ produkt überführt oder (2) ein Sunstrat enzymatisch oxidiert und "das erhaltene Oxidationsprodukt enzymatisch in ein Reduktions- produkt überführt und das gewünschte Endprodukt in an sich bekannter Weise isoliert, wooei für die gekoppelte Oxidation und Reduktion zwei Enzyme verwendet werden, die die gleiche Cofaktorspezifität besitzen. (Dieses Verfahren ist in den Figuren 1 und 3 bis 8 an einigen Beispielen erläutert. )
    [0043] In dem folgenden Reaktionsschema ist der enzymatische Herstellungsprozeß für L-Sorbose aus D-Glucose mit intra¬ sequentieller Cofaktor- (hier NAD /NADH2> Regeneration darσestellt.
    [0044] In den beigefügten Figuren 6 und 8 sind die enzymati¬ schen Reaktionen detaillierter dargestellt.
    [0045] Mit dem erfindungsgemäßen- Verfahren ist es möglich, die Überführung eines primären Reaktionsprodukts in das oxidierte Endprodukt oder die Überführung eines primären Oxidationsprodukts in das reduzierte Endprodukt über eine oder mehrere cofaktorunabhänge Zwischenstufen ab¬ laufen zu lassen, wobei alle Reaktionen im gleichen Reaktor oder getrennt durchgeführt werden können.
    [0046] Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt den großen Vor¬ teil, daß es kontinuierlich und sowohl im halbtechni¬ schen als auch im technischen Maßstab durchgeführt wer¬ den kann.
    [0047] Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt den wesentlichen Vorteil, daß die Co aktoren auf einfache Weise regene¬ riert werden kennen, daß preiswerte Substrate eingesetzt werden können und die Substrate vollständig verwertet werden. Das erhaltene Endprodukt besitzt einen hohen Reinheitsgrad, so daß kaum oder keine Nebenprodukte ent¬ stehen, und die Umwel b lastung sehr gering ist. Die Investitions osten sind ebenfalls niedriσ. Die Oxidations-Reduktions-Reaktionen werden bei den Reaktionsbedingungen durchgeführt, wie sie normaler¬ weise für die Durchführung enzymatischer Reaktionen angewandt werden, beispielsweise liegt der pH-Wert im allgemeinen zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8.
    [0048] Als Reduktionsenzym können beispielsweise L-Hexonat- Dehydrogenase, Äldose-Reduktase, Mannuronat-Dehydro- genäse oder Lactat-Dehydrogenase, und als Oxidations- enzyme können L-Galactonsäure-(L-Gulonsäuire) -Lacton- Dehydrogenase und L-Galactonsäure-(L-Gulonsäure) - Lactonase und Inositol-1-phosphat-Synthase, Fructuronat- Dehydrogenase oder Malat-Dehydrogenasen verwendet werden.
    [0049] Der Cofaktor wird bei dem.erfindungsgemäßen Verfahren nur in katalytischen Mengen verwendet und er kann in* freier Form oder an lösliche Polymere oder an Enzyme gebunden eingesetzt werden. Die Enzyme können in freier oder in immobilisierter Form verwendet werden.
    [0050] Beispiele für Cofaktoren sind:
    [0051] 2+ 1 + Cu /Cu in freier oder komplexierter Form, Fe + /Fe +-Komplexe, wie K Fe(CN) g/K4Fe(CN)6 oder Cyto- chrorne c,
    [0052] Riboflavin,
    [0053] Benzochinon-Hydrochinon,
    [0054] ^T-Naphthochinon, ß-Naphthochinon, natürlich vorkommende oder synthetische Redoxfarbstoffe, wie 2 ,6-Dichlorphenolindophenol, o-Chlorophenolindo-2,6- dichlorphenol, Methylenblau, Wurster's Blau, Triphenyl- tetrazoliumchlorid, Phenzinmethosulfat,
    [0055] Coenzyme, wie NAD NADH2, NADP / DPH2, Q0, Q2, Q6, Q7,
    [0056] FAD/FADH-. und FMN. Bevorzugt werden die Redoxsysteme Nicotinamid-Adenin- Dinucleotid (NAD /NADH-,) oder Nicotinamid-Adenin- Dinucleotid-Phosphat (NADP+/NADPH2) , Fe +/Fe -Cyto- chrom c, 2 ,6-Dichlorphenol-indophenol oder Phenazin- ethosulfat eingesetzt.
    [0057] Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders gut für die enzymatische Herstellung von Vitamin C geeignet. Dabei können, wie in Figur 2 dargestellt, die folgenden Ausgangsmaterialien verwendet werden.
    [0058] (1) D-Galacturonsäure oder D-Galacturonsäure ent¬ haltenden natürlich vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlenhydrate;
    [0059] (2) D-Glucuronsäure oder D-Glucuronsäure enthaltende natürlich -vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlenhydrate;
    [0060] (3) D-Mannuronsäure oder D-Mannuronsäure enthaltende natürlich vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlenhydrate;
    [0061] (4) D-Galactose und/oder D-Glucose und/oder D- Fructose enthaltende Dissaccharide;
    [0062] (5) D-Galatose und/oder D-Glucose und/oder D-Fructose und/oder D-Mannose;
    [0063] ( 6 ) D-Glucose , L-Galactose oder D-Mannose enthaltende Homo-* oder ύeteropolyglycane (vgl. das in Figur 4 dargestellte
    [0064] Feakt ions schemn )
    [0065] ( 7) myo-Inositol bzw. sein Hexaphosphat (Phytinsäure ) oder myo- Inosιt_ol- 1 -phospha . (8) Pectine;
    [0066] (9) Alginsäure (vgl. das in Figur 3 dargestellte Reak¬ tionsschema) ;
    [0067] (10) Stärke, Maltose, Cellulose, Cellobiose oder Saccha¬ rose.
    [0068] In Figur 7 ist ein weiterer Syntheseweg, •der von D-Glu- consäure ausgeht, dargestellt.
    [0069] Die Galacturonsäure bzw. D-Galacturonsäure bzw. Mannuron- säure enthaltenden Homo- oder Heteropolyglycane werden chemisch oder enzymatisch hydrolysiert (vgl. Figur 1) . Die D-Galactose bzw. D-Glucose bzw. D-Mannose enthalten¬ den Homo- oder Heteropolymeren werden chemisch, mikro¬ biologisch oder enzymatisch zu den entsprechenden D-Ga¬ lacturonsäure bzw. D-Glucuronsäure bzw. D-Mannuronsäure enthaltenden Verbindungen oxidiert und dann hydrolysiert.
    [0070] Als vorteilhafter Rohstoff zur Gewinnung von L-Ascorbin¬ säure kommt Pectin in Frage, welches sich zu 15 bis 30% in der Mittellamelle von Pflanzenzellwänden findet. Aus diesem Pectin (zum Beispiel aus Zuckerrübenschnitzeln) wird durch Angriff von Pectinmethylesterasen, Endo- und Exo-Polygalacturonasen, bevorzugt im pH-Bereich 4 bis 6, D-Galacturonsäure erzeugt. Die verwendeten Enzympräpara- ' te müssen zur Erzielung einer hohen Ausbeute an D-Ga¬ lacturonsäure unbedingt lyasefrei sein, da andernfalls Δ-4-5-ungesättigte D-Galacturonsäure-Derivate entstehen, die nicht zu L-Ascorbinsäure weiterumgesetzt werden kön¬ nen.
    [0071] Durch Reduktion von D-Galacturonsäure zu L-Galactonsäu- re mittels L-Hexonat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.20) bzw.
    [0072] Hexuronat-Reductase (EC 1.1.1.19) erhält man L-Galacton- säure, deren γ-Lactose bevorzugt enzymatisch-oxidativ weiter umgesetzt werden kann zu 2-Keto-L-galactonsäure (bzw. deren γ-Lacton) . In bekannter, nicht enzymatisch zu katalysierender Weise erhält man aus dieser Verbin- düng durch Umlagerung L-Ascorbinsäure (vgl. Figur 1) .
    [0073] Die Disaccharide werden chemisch, mikrobiologisch oder enzymatisch oxidiert und darauf folgend enzyma'tisch oder chemisch hydrolysiert, oder sie werden enzymatisch oder chemisch in ihre monomeren Bestandteile gespalten.
    [0074] Die Monosaccharide werden enzymatisch oder chemisch zu den entsprechenden Uronsäuren oxidiert. Das chemische Verfahren erfordert die Einführung und spätere Entfer- nung von Schutzgruppen.
    [0075] Stärke, Maltose, Cellobiose oder Saccharose werden enzy¬ matisch in myo-Inositol umgewandelt und dann enzymatisch über Glucose-1-phosphat zu D-Glucuronsäure oxidiert.
    [0076] Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure, bei dem als Substrat D- Galacturonsäure oder D-Glucuronsäure oder ein Gemisch dieser beiden Säuren verwendet wird. Ein Gemisch dieser beiden Säuren erhält man beispielsweise durch chemische oder enzymatischeOxidation zusammen mit einer Hydrolyse aus Lactose.
    [0077] Die beiden genannten Säuren oder das Gemisch der Säuren werden enzymatisch zu L-Galactonsäure oder L-Gulonsäure oder einem Gemisch dieser Säuren reduziert, und diese werden gegebenenfalls in ihre Lactone oder ein Gemisch der Lactone überführt. Die Säuren oder ein Gemisch der Säuren bzw. die Lactone oder ein Gemisch der Lactone werden dann enzymatisch zu den entsprechenden 2-Keto- Säuren oxidiert und zu Ascorbinsäure umgelagert, welche in an sich bekannter Weise isoliert wird.
    [0078] Es ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens, daß im gleichen Reaktor nicht nur die Oxidations- und Reduktions-Reaktionen, sondern auch Zwischenreaktionen, wie beispielsweise die Lactonisierung oder Überführung der Säuren in andere Derivate durchgeführt werden kann. Anhand der beigefügten Figur 5 wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure aus Lactose näher erläutert.
    [0079] In einer ersten Verfahrensstufe wird dazu aus Lactose durch chemische oder enzymatische Oxidation in Kombina¬ tion mit einem Hydrolyseschritt ein Gemisch von D-Galactu¬ ronsäure und D-Glucuronsäure gewonnen. In einem zweiten enzymkatalysierten Reduktionsprozeß wird aus diesen beiden D-Uronsäuren unter Konfigurationsumkehr (Inversion) ein Gemisch von L-Galactonsäure und L-Gulonsäure erzeugt. Die daraus durch enzymatische Oxidation erhältlichen 2-Keto- L-Galactonsäure und 2-Keto-L-Gulonsäure bzw. deren y - Lactone (Stufe 3) gehen unkatalysiert in L-Ascorbinsäure (Vitamin C) über.
    [0080] Durch Auswahl geeigneter Enzyme (E1 , E,) mit kompatiblen Cofaktoren lassen sich der Reduktionsschritt (Stufe 2, E.,) und der Oxidationsschritt (Stufe 3, E' 2) miteinander zu einem kontinuierlichen Prozeß verknüpfen. Mit diesen konjugierten Redoxreaktionen wird gleichzeitig für eine kontinuierliche Regeneration der in den von -E bzw. E-, katalysierten Einzelschritten jeweils benötigten Coenzyme (Redoxsysteme) gesorgt, so daß diese nur in katal tischen Mengen eingesetzt zu werden brauchen.
    [0081] Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren anfallenden End¬ produkte können in an sich bekannter Weise abgetrennt werden und müssen aus dem Gleichgewicht entfernt werden. Sie können beispielsweise durch Absorptionschromatogra¬ phie, Verteilungschromatographie, Ionenaustauschchromato- graphie, fraktionierte Kristallisation, Elektrodialyse oder elektrodialytische Fokussierung abgetrennt bzw. isoliert werden.
    [0082] Die bei dem oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Vitamin C verwendete D-Glucuronsäure kann ebenfalls -erfindungsgemäß durch enzymatische Reduktion von D- Mannuronsäure zu D-Mannonsäure und anschließende Oxi¬ dation der D-Mannonsäure zu D-Fructuronsäure und Isomerisierung der D-Fructuronsäure zu D-Glucuronsäure hergestellt werden. Damit kommt auch Alginsäure als preis- wertes Ausgangsmaterial in Frage (vgl. Figur 3) .
    [0083] L-Sorbose ist ein Zwischenprodukt zur Herstellung von Vitamin C, und diese Verbindung kann aus D-Glucose oder aus D-Fructose hergestellt werden. D-Glucose oder D-Fructo- se werden enzymatisch zu D-Sorbitol reduziert, und D-Sor¬ bitol wird enzymatisch zu L-Sorbose oxidiert (vgl. Fig. 6,8)
    [0084] Es ist ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens, daß eine Umwandlung der D-Formen in die ge- wünschte L-Form auf enzymatische Weise erfolgen kann. Derartige Umwandlungen sind sonst nur schwer zu errei¬ chen und werden in der Reichstein-Synthese deshalb mikro¬ biologisch vorgenommen (vgl. die obigen Reaktionsschemata). Die erfindungsgemäßen Oxidations-Reduktionsreaktionen können beispielsweise in einem Reaktor mit Ultrafiltra¬ tionsmembran durchgeführt werden, wobei ein Cofaktor- system verwendet wird, das an ein wasserlösliches Polymeres mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 5000 und 30.000 Dalton gebunden ist. über die Membran des Reaktors wird eine Druckdifferenz erzeugt, und hinter der Membran wird kontinuierlich ein Produkt¬ strom abgeführt.
    [0085] Erfindungsgemäß kann man als Membranen Hohlfasern ver ¬ wenden, .die in ihrer Struktur asymmetrisch aufgebaut sind, wobei die für Enzyme und polymergebundene Coenzyme undurchlässige selektive Schicht der Membran auf der Außenseite der Hohlfaser liegt, während die Innenseite der Faser Poren enthält, die auch für die Enzyme und Coenzyme durchlässig sind.
    [0086] Die Substratlösung wird dann auf der Innenseite der Hohlfasermembran eingeführt, zwischen der Innen- und Außenwand der Faser wird eine hydrostatische Druck¬ differenz erzeugt, so daß die Substratlösung durch die innere Faserwand hindurchgeht und die enzymatischen Reaktionen bevorzugt im porösen Stützmaterial zwischen Innenwand und Außenwand ablaufen.
    [0087] Durch geeignete Wahl der hydrostatischen Druckdifferenz kann man den Durchsatz der Substrate so einstellen, daß ihre Aufenthaltszeit in der Hohlfaserwand ausreicht, um eine möglichst vollständige Umsetzung zu erzielen.
    [0088] Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die eigentliche für Enzyme und polymergebundene Cofaktoren undurch¬ lässige selektive Schicht der Membran auf der Innenseite der Hohlfaser liegen und die enzymatische Reaktion im ■ Lumen der Hohlfaser ablaufen. Zu der Reaktionslösung kann man gegebenenfalls ein Schutzprotein in einer Menge,
    [0089] 4 die dem 1- bis 10 fachen der Menge der beteiligten Enzyme entspricht, zusetzen.
    [0090] Das Gemisch aus Restsubstrat, Produkt, Enzym und Co- faktor kann auch durch ein Membranmodul durchgeströmt 5 werden, dessen Membranporen so ausgestaltet sind, daß sie nur das Produkt sowie Restsubstrat hindurchlassen, die übrigen Komponenten jedoch zurückhalten, wobei letztere wieder in den Reaktor zurückgeführt werden.
    [0091] 10. Die im Reaktor gemeinsam vorliegenden Enzyme können verschiedene Halbwertszeiten ihrer Inaktivierung auf¬ weisen. Um über einen längeren Zeitraum hinweg den Reaktor funktionsfähig zu halten, werden die Enzyme dem Reaktor in einem Aktivitätsverhältnis zwischen
    [0092] 15 10:1 und 1:10 zugefügt, wobei das Enzym mit der schnelleren Inaktivierung anfangs im Überschuß vorliegt. Auch durch Nachdosierung einzelner gelöster Enzyme oder des Cofaktors während des Produktionsprozesses können die Substrat- umsatzraten je Zeiteinheit von Vorwärts- und Rückwärts-
    [0093] 20 reaktion wieder aufeinander abgestimmt werden.
    [0094] Einige-der benötigten Enzyme sind wie im Falle der Sorbitol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.14) aus Schafsleber oder Candida utilis,_oder der Lactat-Dehydrogenase
    [0095] 25 (EC 1.1.1.27) aus verschiedenen tierischen Geweben oder der Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.38) aus Schweineherz oder der Pectinasen (als Pectinol K oder rohament P) im Handel erhältlich. letztere Quellen können auch zur Reindarstellung pectinolytischer Enzyme verwendet
    [0096] 30 werden.
    [0097] Die weiteren Enzyme lassen sich z.B. aus folgenden Quellen isolieren:
    [0098] 35 Sorbitol-DH EC 1 . 1 . 1 . 1 4 Lactobacillus brevis , ( Iditol-DH) Zymomonas mobilis , Gluconobacter xylinum Acetobacter suboxydans
    [0099] Glucuronat-Peduktase 1 . 1 . 1 . 1 9 Leber, Hefen
    [0100] L-Hexonat-Dehydrogenase 1 . 1 . 1 .20 Erwinia carotevora, Euglenia gracilis, Erb sen, S. cerevisiae, Saccharomyces lipolytic Lipomyces starkeyi, Schwanniomyces ocσiden talis, Aspergillus nige u.a. Hefen
    [0101] Aldose-Reduktase 1.1.1.21 Leber, Zymomonas mobil Pichia stipidis, B. ma cerans
    [0102] Lactat-DH 1.1.1.27 Bacillus subtilis,
    [0103] Schweinemuskel, B. ste rothermophilus
    [0104] Malat-DH 1.1.1.37 Neurospora crassa, Sch neherz, B.subtilis, B. stearσt mophilus, Thermus. ther philus
    [0105] Malat-DH, 1.1.1.38 Bakterien decarboxylierend 1.1.1.39 Streptococcus faecalis
    [0106] Fructuronat-Reduktase 1.1.1.57 Bakterien
    [0107] Mannitol-DH (NAD) 1.1.1.67 Bakterien, Hefen
    [0108] 5-Ketogluconat-Reduk- 1.1.1.69 Gluconobacter, Kleb- tase AD (P) siella, E. coli
    [0109] L-Sorbose-DH 1.1.1.123 Gluconobacter sp. ,
    [0110] Lactobacillus brevis, E.coli
    [0111] Fructose-b-DH 1.1.1.124 Gluconobacter cerinus
    [0112] Mannuronat-DH 1.1.1.131 Aeromonas Mannitol-DH (NADP) 1.1.1.138 lactobacillus brevis, Penicillium chrysogenum
    [0113] Polyol-DH 1.1.1.139 Saccharomyce s
    [0114] L-Aldono-_.-lacton- 1.1.3.8 Serratia, Saccharo- Oxidase myces cerevisiae, Pseudomonas, Grün¬ algen, Leber
    [0115] Mannitol-DH 1.1.2.2 Aerobacter sub-
    [0116] (Fe-Cytochrom c) oxidans, Bac. poly- myxa
    [0117] Mannonat-DH 1.2.1.34 Bakterien
    [0118] L-Aldono-. -lacton-DH 1.3.2.3 Erbsen, Blumenkohl, Hefen
    [0119] myo-Inositol-Oxi- 1.13.99.1 Rattenhiere, Pflan¬ genäse zen
    [0120] Phosphorylase 2.4.1.1 Kartoffeln, Tomaten
    [0121] Saccharose-Phos- 2.4.1.7 Pseudomonas saccha- phorylase rophilia
    [0122] Maltose-Phosphory- 2.4.1.8 Leuconostoc läse mesenteroides
    [0123] Cellobiose-Phos- 2.4.1.20 Bakterien phoryla≤e
    [0124] Phosphoglucose utase 2.7.5.5 Bakterien
    [0125] Pectinrrethvlesterase 3.1.1.11 Aspergillus niger
    [0126] L -Aldonolac tonase 3.1.1.18 Leber, Grünalgen Phytin-3-phos- 3.1.3.8 Bakterien phatase
    [0127] myo-Inositol-1* 3.1.3.25 Aspergillus sp., phosphatase Hefe
    [0128] Phytin-6-phos¬ 3.1.3.26 Pflanzen phatase
    [0129] Endo-Polygalac- 3.2.1.15 Aspergillus niger turonase
    [0130] Exo-Polygalacturo- 3.2.1.67 Pectinol K, Rohament nase P, Äpfel, Zitrus- früchte
    [0131] Exo-Poly-^- 3.2.1.82 dto , Erwin ia
    [0132] Galacturonosidase
    [0133] Glucuronat- Isomerase 5 . 3 . 1 . 1 2 E.coli
    [0134] myo-Inositol-1- 5.5.1.8 Schwanniomyces phosphat-Synthase occidentalis, Can- dida utilis
    [0135] L-Sorbose-DH Bacillus, Hefen, Gluconobacter mela- noαenum
    [0136] L-Sorboson-DH Acetobacter suboxi- dans, Gluconobacter melanogenum
    [0137] L-Sorboson-Oxidase Pseudomonas putida,
    [0138] Gluconobacter melanogenum Älginasen ' Alginobacter, Algino- monas, Alginovibrio Actinomyces Pseudomonas maltophi- lia, Pseudomonas pu- tida
    [0139] Aerobacter, Aeromonas, Bacterium, Bacteroides Klebsiella, Vibrio
    权利要求:
    ClaimsP A T E N T A N S P R Ü C H E
    1. Verfahren zur intrasequentiellen Cofaktor-Regeneration bei zwei- oder mehrstufigen enzymatischen Synthesen, dadurch ge ¬ k e n n z e i c h n e t , daß man im gleichen Reaktor oder auch einzeln (1) ein Substrat enzymatisch reduziert und das dabei erhaltene Reduktionsprodukt enzymatisch in ein Oxidationspro¬ dukt überführt oder
    (2) ein Substrat enzymatisch oxidiert und das dabei erhaltene Oxidationsprodukt enzymatisch in ein Reduktionspro¬ dukt überführt und
    das gewünschte Endprodukt in an sich bekannter Weise iso¬ liert, wobei für die gekoppelten Vorgänge der Oxidation und Reduktion zwei Enzyme verwendet werden, die die gleiche Cofaktor- Spezifität besitzen.
    2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß die Überführung des primären Reduktionsprodukts in das oxidierte Endprodukt oder die Überführung des primären Oxidationsprodukts in das reduzierte Endprodukt über eine oder mehrere von dem jeweils betroffenen Cofaktor unabhängige Zwischenstufen abläuft, die im gleichen Reaktor oder auch einzeln durch¬ geführt werden.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e ¬ k e n n z e i c h n e t , daß es kontinuierlich durch¬ geführt wird.
    4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß bei der Oxi- dations-Reduktions-Reaktion der pH-Wert zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8, gehalten wird.
    5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß als
    Reduktionsenzyme beispielsweise L-Hexonat-Dehydrogenase, Aldose-Reduktase, Mannuronat-Dehydrogenase oder Lactat- Dehydrogenase, als Oxidationsenzyme L-Galactonsäure-(L- Gulonsäure)-Lacton-Dehydrogenase, Inositol-1-phosphat- Synthase, Fructuronat-Dehydrogenase oder Malat-Dehydro- genasen verwendet werden.
    6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch- g e k e n n z e i c h n e t , daß der Cofaktor in katalytischen Mengen verwendet wird.
    7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß als Cofaktor Cu /Cu in freier oder komplexierter Form oder Fe /Fe -Komplexe, wie K Fe (CN) g/K Fe (CN) - oder Cytochrome c, Riboflavin, Benzochinon/Hydrochinon, «.-Naphthochinon, ß-Naphthochinon oder natürlich vorkom- mende oder synthetische Redoxfarbstoffe, wie 2,6-Dichlor- phenolindophenol, o-Chlorphenolindo-2,6-dichlorphenol, Methylenblau, Wurster's Blau, Triphenyltetrazolium- chlorid, Phenazinmethosulfat, oder Coenzy systeme, wie NAD+/NADH2, NADP+/NADPH2, Q0, Q2, Q6, Q7, FAD/FADH und FMN, verwendet werden, bevorzugt jedoch die Redox¬ systeme Nicotin_.mid-Adenin-Dinucleotid (NAD+/NADH2) oder
    Nicotinamid-Adenin-Dinucleo_tid-Phosphat (NADP' /NADPH-) ,
    2+ 3+ ^
    Fe /Fe -Cytochrome c, 2,6-Dichlorphenol-Indophenol oder Phenazinmethosulfat eingesetzt werden.
    8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch g e k e n n z-e l e h n e t , daß der Cofaktor in freier Form oder an Partikel oder an lös- liehe Polymere oder an Enzyme gebunden und die Enzyme in freier oder in immobilisierter Form verwendet werden.
    9. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche zur enzymatischen Herstellung von L-Ascorbin- säure , dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man als Substrat D-Galacturonsäure oder D-Glucuronsäure oder ein Gemisch dieser beiden Säuren verwendet, das jeweilige Substrat enzymatisch zu L-Galactonsäure oder L-Gulon¬ säure oder einem Gemisch dieser Säuren reduziert und L-Galactonsäure oder L-Gulonsäure oder ein Gemisch dieser Säuren in die entsprechenden y-Lactone oder das Gemisch der y-Lactone enzymatisch oder chemisch in an sich bekannter Weise überführt, das erhaltene '-Lacton oder das Gemisch aus den ;--'-Lactonen enzymatisch zu 2-Keto-L-gulonsäure oder 2-Keto-L-galactonsäure oder einem Gemisch dieser Säuren bzw. zu den .'-Lactonen oder einem Gemisch der '--Lactone oxidiert und in an sich bekannter Weise zu L-Ascorbinsäure umlagert und das Produkt gewinnt, wobei alle enzymatischen Reaktio- nen im gleichen Reaktor oder auch getrennt durchgeführt werden.
    10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß bei der Reduktion als Enzyme L-Hexonat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.20) oder Glucuronat- Reduktase (EC 1.1.1.19), bei der Oxidation L-Aldono- - lacton-Oxidase (EC 1.1.3.8) oder L-Aldonsäure-^-lacton- Dehydrogenase (EC 1.3.2.3) verwendet werden und daß die Überführung der -onsäuren in die y-Lactone durch eine L-Aldonolactonase (EC 3.1.1.18) bzw. eine schwache Säure erfolgt.
    11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von D-Glucuronsäure, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
    i. D-Mannuronsäure enzymatisch zu D-Mannonsäure reduziert wird;
    ii. die D-Mannonsäure anschließend enzymatisch zu D-Fructuronsäure oxidiert wird und
    iii. die Fructuronsäure zu D-Glucuronsäure isomeri- siert wird,
    wobei'alle Reaktionen im gleichen Reaktor oder auch ein- zeln durchgeführt werden.
    12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur enzymatischen Herstellung von L-Sorbose aus Glucose, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
    i. D-Glucose zu D-Sorbitol unter Verwendung einer Aldose-Reduktase (EC 1.1.1.21) enzymatisch re¬ duziert wird und
    ü. D-Sorbitol zu L-Sorbose enzymatisch unter Ver¬ wendung einer Sorbitol-Dehydrogenase, L-Iditol- Dehydrogenase (EC 1.1.1.14) oder L-Sorbose-De- hydrogenase (EC 1.1.1.123) oxidiert wird,
    wobei die Reaktionen im gleichen Reaktor oder aber sepa¬ rat durchgeführt werden.
    13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur enzymatischen Herstellung von L-Sorbose aus D-Fructose, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
    i. . D-Fructose zu D-Sorbitol enzymatisch unter Ver¬ wendung von Sorbitol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.14) bzw. iner Polyoldehydrogenase (EC 1.1.1.139) reduziert wird.
    ii. D-Sorbitol zu L-Sorbose unter Verwendung von einer Sorbitol-Dehydrogenase, L-Iditol-Dehydro- genase oder L-Sorbo≤e-Dehydrogenase (EC 1.1.1.123) oxidiert wird,
    wobei die Reaktionen im gleichen Reaktor oder auch einzeln durchgeführt werden.
    14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur enzymatischen Herstellung von L-Sorbose aus D-Fructose, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
    i. D-Fructose durch eine 5-Keto-Fructose-Reduktase aus Gluconobacter cerinus (EC 1.1.1.124) zu 5-Keto-Fructose enzymatisch oxidiert wird und
    ii. 5-Keto-Fructose durch eine 5-Keto-Fructose- Reduktase aus Hefe (EC 1.1.1.124) enzymatisch zu L-Sorbose reduziert wird,
    wobei die beiden komplementären Reaktionen jeweils im gleichen Reaktor oder auch einzeln durchgeführt werden .
    15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
    5 i. L-Sorbose zu L-Sorboson unter Verwendung von
    L-Sorbose-Dehydrogenase ls Enzym oxidiert wird und
    ii. L-Sorboson unter Verwendung von L-Sorboson-Oxi- 0 dase oder L-Sorboson-Dehydrogenase zu 2-Keto-L- gulonsäure oxidiert wird.
    16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch g e k e n n - 5 z e i c h n e t , daß die beiden oxidativen Dehydrcgenase-ϊteak- tionen, die zur Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sor¬ bose führen, mit der reduktiven Umsetzung von D-Fructose zu Mannitol mittels Mannitol-Dehydrogenase' gekoppelt wird, wobei alle Reaktionen im gleichen Reaktor oder auch ein- Q zeln durchgeführt werden.
    17. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch g e ¬ k e n n z e i c h n e t , daß als Ausgangsmaterialien
    5 ( 1 ) D-Galacturonsäure enthaltende natürlich vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohle¬ hydrate ;
    (2) D-Glucuronsäure enthaltende natürlich vorkommende 0 oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlehydrate;
    (3) D-Mannuronsäure enthaltende natürlich vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlehydrate;
    5 (4) D-Galactose und/oder D-Glucose und/oder D-Fructose enthaltende Disaccharide; (5) D-Galactose und/oder D-Glucose und/oder D-Fructose und/oder D-Mannose;
    (6) D-Glucose, D-Galactose oder D-Mannose enthaltende Homo- oder Heteropolyglykane;
    (7) myo-Inositol bzw. sein Hexaphosphat (Phytinsäure) oder myo-Inositol-1-phosphat;
    (8) Pectine;
    (9) Alginsäure;
    (10) Stärke, Maltose, Cellobiose, Lactose oder Saccharose verwendet werden.
    18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung von L-Ascorbinsäure -aus Pectinen durch
    (1) . enzymatische Hydrolyse des Pectins zu Pectinsäure bei pH 4-9;
    (2) enzymatische Hydrolyse der Pectinsäure zu D-Galacturon¬ säure bei pH 4-6; (3) Lactonisierung der D-Galacturonsäure zu ihrem -Lacton;
    (4) Reduktion der Galacturonsäure bzw. ihres -Lactons zu L-Galactonsäure bzw. dessen ι -Lacton;
    (5) Oxidation des L-Galactonsäure-; -lactons zu 2-Keto- L-Galactonsäure-. -lacton sowie Umlagerung zu L-Ascorbinsäure,
    dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
    a) die Stufen (1) und (2) getrennt oder in einem ge¬ meinsamen Reaktor durchgeführt werden; b) die Stufen (3) , (4) und (5) gemeinsam in einem Reaktor durchgeführt werden;
    c) die Hydrolyse-Reaktionen (1) und (2) enzymatisch ablaufen;
    d) die Bildung des L-Galactonsäure- -lactons (3) enzymatisch oder chemisch vorgenommen wird;
    e) die Reduktion der D-Galacturonsäure bzw. ihres )i-Lactons zu L-Galactonsäure (4) bzw. ihres y- Lactons enzymatisch erfolgt;
    f) die Oxidation des L-Galactonsäure-,}-lactons zu 2-Keto-L-galactonsäure-γ-lacton enzymkatalysiert abläuft und
    g) die Reaktionen (4) und (5) über ein gemeinsames Redoxsystem (Cof aktor System) miteinander verknüpft sind.
    19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß der gekoppelte Reduktions- (7) und Oxidationsprozeß (5) mit Hilfe des intersequentiellen Regenerationssystems g) kontinuierlich durchgeführt werden kann.
    20. Verfahren nach Anspruch 10 oder 19, dadurch g e ¬ k e n n z e i c h n e t , daß als Hydrolyseenzym (1) Pectinmethylesterase (EC 3.1.1.11) , als Hydrolyseenzym (e) (2) ein Komplex oder ein Gemisch aus Endo-Polygalacturonase
    (EC 3.2.1.15) und Exo-Polygalacturonase (EC 3.2.1.67) sowie Exo-Poly-Λ-D-Galacturonosidase (EC 3.2.1.82) , als Reduktionsenzym (4) eine L-Hexonat-Dehydrogenase oder eine D-Glucuronat-Reduktase (EC 1.1.1.19), zur Bildung des entsprechenden -Lactons (3) eine L-Aldono-
    Lactonase (EC 3.1.1.18) bzw. eine schwache Säure, und als Oxidationsenzym eine L-Galactonsäure-^'-lacton Dehydrogenase verwendet werden.
    21." Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung von Ascorbinsäure aus Alginsäure durch
    (1) Hydrolyse der Alginsäure zu D-Mannuronsäure und L-Guluronsäure;
    (2) Reduktion der D-Mannuronsäure zu D-Mannonsäure;
    (3) Oxidation der D-Mannonsäure zu D-Fructuronsäure und
    (4) Isomerisierung der D-Fructuronsäure zu D-Glucuron¬ säure;
    (5) Umwandlung von D-Glucuronsäure in L-Ascorbin¬ säure gemäß Anspruch 9,
    dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
    a) die Stufen (2) , (3) und (4) gemeinsam in einem Reaktor- durchgeführt werden;
    b) die Hydrolysereaktion (1) enzymatisch oder chemisch abläuft;
    c) die Reduktion von D-Mannuronsäure zu D-Mannon¬ säure (2) enzymatisch erfolgt;
    d) die Oxidation von D-Mannonsäure zu D-Fructuron¬ säure (3) enzymatisch katalysiert wird;
    e) die Isomerisierung von D-Fructuronsäure zu D-Glucuronsäure (4) sowohl chemisch als auch enzymatisch durchgeführt werden kann, und
    f) die Reaktionen (2) und (3) über ein gemeinsames Redoxs stem (Cofaktorsyste ) miteinander verknüpft sind.
    22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch g e k e n n¬ z e i c h n e t , daß der gekoppelte Reduktions- (2) und Oxidationsprozeß (3) mit Hilfe des intrasequentiel¬ len Cofaktor-Regenerationssystems kontinuierlich durch- führbar ist.
    23. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, 21 oder 22, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß die hydrolytische Spaltung der Alginsäure (1) mit verdünnten Säuren oder enzymatisch durch alginolytische Enzyme, wie
    Polyuronasen (Alginasen), erfolgt, für den Reduktions¬ schritt (2) eine D-Mannuronat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.131) oder eine I ^___nnonat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.34) , für den Oxidationsschritt (3) eine Fructuronat-Reduktase
    (EC 1.1.1.57) und für die Isomerisierung zu D-Glucuron- säure (4) eine Glucuronat-iso erase (EC 5.3.1.12) oder eine verdünnte Säure verwendet werden.'
    24. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 zur enzymatischen Herstellung von D-Glucuronsäure aus -stärke, Saccharose, Maltose, Cellobiose oder Phytinsäure durch
    (1) phosphorolytische Spaltung der betreffenden Poly- oder Disaccharide zu Glucose- 1 -phosphat;
    (2) Umwandlung zu Glucose-6-phosphat ;
    (3) oxidative Cyclisierung zu Inositol-1 -phosphat ;
    (4) Hydrolyse des Phosphatrests in 1 -Stellung;
    (5) Oxidation des myo-Inositols zu D-Glucuronsäure oder
    (6) Hydrolyse der Phosphatreste von Phytinsäure (myo- Inositol-hexaphosphat ) und anschließende Oxida¬ tion gemäß (3) , dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
    a) die phosphorolytische Spaltung (1) enzymatisch erfolgt;
    b) die Umwandlung (2) enzymatisch durchgeführt wird;
    c) die oxidative Bildung des Cyclitols (3) enzyma- tisch erfolgt;
    d) die Abspaltung der Phosphatreste (4) , (6) durch enzymatischen Angriff oder chemisch erfolgt und
    e) die Oxidationsreaktion (5) enzymatisch durchge¬ führt wird.
    25. Verfahren nach Anspruch 24 zusammen mit dem Ver¬ fahren der Ansprüche 9 oder 10, dadurch g e k e n n - z e i c h n e t , daß die oxidative Cyclisierung von Glucose-6-phosphat zu myo-Inositol-1-phosphat (3) mit der Reduktion von D-Glucuronsäure (bzw. ihrem y-Lacton) zu Gulonsäure (bzw.1 ihrem •.' -Lacton) über einen gemein¬ samen Cofaktor (Redoxsystem) miteinander verknüpft ist und diese beiden Reaktionen gemeinsam mit (4) und (5) im gleichen Reaktor kontinuierlich ablaufen und in diesem Fall die weitere Oxidation von L-Gulonsäure-y- lacton zu 2-Keto-L-gulonsäure- -lacton durch eine Oxidase (EC 1.1.3.8) katalysiert wird.
    26. Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die phosphorolytische Spaltung von Stärke oder Saccharose (1) mit Phosphory- lasen (EC 2.4.1.1; EC 4.2.1.7, EC 2.4.1.8) erfolgt-und die Umwandlung (2) eine Phosphoglucomutase (EC 2.7.5.5) , für den Prozeß der oxidativen Cyclisierung (3) eine myo- Inositol-1-phosphat-Synthase (EC 5.5.1.8) , für die hydrolytische Abspaltung der Phosphatreste (4), (6) spezifische Phosphatasen (EC 3.1.3.8; EC 3.1.3.25; EC 3.1.3.26), für die Oxidationsreaktionen zu D- Glucuronsäure (5) eine myo-Inositol-Oxygenase (EC 1.13.99.1) und für die Oxidation von L-Gulonsäure- y-lacton eine L-Gulonolacton-Oxidase (EC 1.1.3.8) ver¬ wendet werden.
    27. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus D- Gluconsäure, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß
    i. D-Gluconsäure zu 5-Keto-D-gluconsäure durch 5-Keto- gluconat-Reduktase (EC 1.1.1.69) oxidiert wird und
    ii. 5-Ketogluconat durch eine Idonat-Dehydrogenase aus Brevibacterium oder Fusarium zu L-Idonsäure redu¬ ziert wird und nachfolgend
    iii. L-Idonsäure durch Enzyme aus Pseudomonas, Aceto¬ bacter oder Micrococcen zu 2-Keto-L-gulonsäure oxi¬ diert wird und
    iv. gleichzeitig D-Fructose durch Sorbitol-Dehydrogena¬ se (z.B. EC 1.1.1.14) zu D-Sorbitol oder durch Man¬ nitol-Dehydrogenase (z.B. EC 1.1.1.67) zu Mannitol reduziert wird.
    28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch g e k e n n¬ z e i c h n e t , daß
    i. die enzymatische Oxidation von D-Gluconsäure zu 5- Keto-D-gluconsäure mit der enzymatischen Reduktion von D-Fructose zu D-Sorbitol oder D-Mannitol gekop¬ pelt wird und dadurch der gemeinsame Cofaktor rege- neriert wird und damit kontinuierlich gearbeitet werden kann und
    die nachfolgende Reduktion von 5-Keto-D-gluconsäu- re zu L-Idonsäure mit der vom gleichen Cofaktor ab¬ hängigen enzymatischen Oxidation von L-Idonsäure zu 2-Keto-L-gulonsäure zu einem intrasequentiellen Co- faktorregenerationssystem verknüpft wird.
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    US8080397B2|2011-12-20|Biocatalystic synthesis of quinic acid and conversion to hydroquinone by recombinant microbes
    Jeffries1983|Utilization of xylose by bacteria, yeasts, and fungi
    Cheetham et al.1993|Bioconversion of D-galactose into D-tagatose
    Loewus1999|Biosynthesis and metabolism of ascorbic acid in plants and of analogs of ascorbic acid in fungi
    KR101021234B1|2011-03-11|미생물에 의한 비타민 ｃ의 생성 방법
    Hettinga et al.1972|The propionic-acid bacteria–a review: II. Metabolism
    Pappenberger et al.2013|Industrial production of L-ascorbic acid | and D-isoascorbic acid
    Chiang et al.1981|D-Xylulose fermentation to ethanol by Saccharomyces cerevisiae
    Vasic-Racki2006|History of industrial biotransformations—dreams and realities
    Himmi et al.2000|Propionic acid fermentation of glycerol and glucose by Propionibacterium acidipropionici and Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii
    Gong et al.1981|Production of ethanol from D-xylose by using D-xylose isomerase and yeasts
    CA1293212C|1991-12-17|Carbohydrate refining process and novel enzyme compositions suitable for use therein
    Silveira et al.2002|The biotechnological production of sorbitol
    US6057135A|2000-05-02|Process for manufacturing D-tagatose
    Richard et al.2009|D-galacturonic acid catabolism in microorganisms and its biotechnological relevance
    Leonida2001|Redox enzymes used in chiral syntheses coupled to coenzyme regeneration
    KR950009199B1|1995-08-16|2-케토-l-굴론산의 제조방법
    Canete-Rodriguez et al.2016|Gluconic acid: properties, production methods and applications—an excellent opportunity for agro-industrial by-products and waste bio-valorization
    Yasohara et al.1999|Synthesis of optically active ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate by microbial reduction
    CN100347309C|2007-11-07|生产维生素c的方法
    US4342831A|1982-08-03|Fermentable acid hydrolyzates and fermentation process
    US5096820A|1992-03-17|Process for manufacturing xylitol and xylitol-rich products
    Gunsalus et al.1955|Pathways of carbohydrate metabolism in microorganisms
    EP1756291B1|2010-07-07|Enzymatische decarboxylierung von 2-keto-l-gulonsäure zur herstellung von xylose
    Nigam et al.1995|Processes of fermentative production of xylitol—a sugar substitute
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE3502141C2|1991-08-29|
    DE3502141A1|1986-10-16|
    JPS62501747A|1987-07-16|
    EP0209583A1|1987-01-28|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1986-07-31| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    1986-07-31| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1986-09-03| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1986901053 Country of ref document: EP |
    1987-01-28| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1986901053 Country of ref document: EP |
    1989-11-11| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1986901053 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    [返回顶部]